生物酶催化法生产γ-氨基丁酸项目

一、γ—氨基丁酸简介

 

1.1、γ-氨基丁酸的结构和性质

   γ—氨基丁酸(英文名γ-aminobutyric acid或γ-aminobutanoic acid,简称GABA),又名4-氨基丁酸、氨酪酸。GABA是一种白色或近白色结晶性粉末,极易溶于水,微溶于热乙醇,不溶于冷乙醇、苯、乙醚。其熔点(mp):203~204℃(分解),熔化分解成并吡咯烷酮和水。GABA的解离常数:pKCOOH=4.03,pKNH3=10.56,无旋光性。分子式为C4H9NO2,相对分子量103.2,结构式如下图所示。

 

1.2、γ—氨基丁酸的生理功效

    早在1883年GABA就己经被人工合成出来,1910年时已经有人从微生物活动的产物中检测出了它的存在,1949年,Steward等报道了GABA在马铃薯中的天然存在,这些发现都未被人们所关注,直到1950年Roberts和Awapara的两个研究小组几乎同时发现在哺乳动物脑内存在高浓度的自由态GABA,Roberts还进一步证明了GABA是由谷氨酸在谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)的作用下转化而来的。在此之后由于Krnjevic等人的努力,GABA的意义和作用逐渐被揭示出来。在1975年的第二届国际GABA专题讨论会上,GABA被正式确认为哺乳动物中枢神经系统(CNS)的一种抑制性神经递质。研究表明,GABA在GABA能神经元的代谢中起核心作用,是最重要的神经抑制递质之一。GABA是中枢神经系统内最重要的抑制性氨基酸递质,具有突触后抑制作用,可通过突触后膜超极化、减少离子内流、降低细胞代谢及氧消耗等机制,使突触后神经元处于保护性抑制状态,并可通过突触前抑制减少谷氨酸的释放,从而减少灌注区神经元的死亡。GABA的功能主要有以下几点:

1.2.1、镇静安神

    γ-氨基丁酸属强神经抑制性氨基酸,具有镇静、催眠、抗惊厥、降血压的生理作用。它是抑制性神经递质(Inhibitory Neurotransmitter),可以抑制动物的活动,减少能量的消耗,被称作“大脑的天然镇静剂”。GABA能结合抗焦虑脑受体并使之激活,然后与另外一些物质协同作用,阻止与焦虑相关的信息抵达脑指示中枢。因此,GABA可从根本上镇静神经,从而起到抗惊厥和抗焦虑的效果。氨基丁酸作用于动物细胞中的GABA受体,GABA受体是一个氯离子通道,GABA的抑制性或兴奋性是依赖于细胞膜内外的氯离子浓度的,GABA受体被激活后,导致氯离子通道开放,能增加细胞膜对氯离子通透性,使氯离子流入神经细胞内,引起细胞膜超极化,抑制神经细胞元激动,从而减少动物的运动量。

1.2.2、促生长机理

    它是通过减少动物的无意识运动,来减少能量消耗,γ-氨基丁酸能促进动物胃液和生长激素的分泌,从而提高生长速度和采食量;能兴奋动物的采食中枢,增加采食量,从而达到促生长的目的。

1.2.3、调节激素的分泌

    GABA是脑内抑制性通路的重要物质,对内分泌功能尤其对腺垂体激素分泌功能有重要的调节作用。研究表明,GABA能促进腺量体分泌黄体生成素,并具有促进甲状腺素释放激素的功能。GABA可抑制促肾上腺皮质激素的释放。它可能通过突触前抑制使促黄体生成素释放激素减少从而导致黄体生成素的分泌下降;此外,GABA还调节黑色细胞刺激素、催乳素、生长激素、促肾上腺素的分泌。

γ-氨基丁酸是一种天然氨基酸,广泛分布于动植物体内。它存在于动物的中枢神经系统中,是神经系统中信息交流过程的基本物质载体。发挥强力抗应激功效,可有效防治畜禽烦躁不安、咬尾、打斗、啄羽、啄肛等应激综合征,并能调节植物神经功能,消除异食癖。改善动物血液循环功能,提高畜禽免疫力和抗病力,使畜禽对应激环境和生活环境产生更好的抵抗力,增强食欲,加快饲料养分消化、吸收,消除畜禽挑食、厌食,提高日增重和饲料转化率。

 

二、γ-氨基丁酸制备技术

    γ-氨基丁酸作为一种非蛋白质氨基酸,在动物、植物和微生物中均有GABA存在,是一种重要的抑制性神经传导物质,是很好的医疗药物及保健品的原料,具有降血压、保持神经安定、改善脑机能、保肝利肾等作用,可作为治疗脑损伤药物的成分,对畜禽具有抗热应激、促生长等作用,目前已发戓成为一种新型功能性因子,被广泛用于医药、食品保健、化工及农业等行业。近年来,国内外市场对γ-氨基丁酸的需求逐年增长。但是GABA天然存在含量很低,因此很难从天然组织中提取分离,γ-氨基丁酸的生产方法主要有化学合成法、固态发酵法和生物酶转化法。

化学合成法主要采用吡咯烷酮、氢氧化钠和水按一定比例混合后,在高温下进行反应,反应条件剧烈,然后通过树脂分离纯化,浓缩结晶而成。吡咯烷酮与氢氧化钠都为腐蚀性物质,影响人体健康。特别是吡咯烷酮在高温下,有引起燃烧的危险,且可分解释放有毒的氧化氮烟气,操作过程存在危险性,不利于工业化大规模生产。另外还有一些化学合成方法,多见于专利文献的报道,成本较高,得率较低,并且在生产工艺中使用危险溶剂,甚至是强腐蚀、有毒溶剂,其产品主要应用于生化研究。

固态发酵法效率低下,产量仅为0.35mg/g,最终纯度只35%。。生物酶催化合成法主要以重组基因工程菌代谢中产生的谷氨酸脱羧酶GAD,转化底物谷氨酸生产γ-氨基丁酸,与化学法相比,生物酶催化合成法具有条件温和、安全和成本较低的优点生物酶催化法生产过程污染小,成本低廉,生物催化法已成为目前γ-氨基丁酸主要的生产方式,生物催化法生产GABA以重组大肠基因工程菌为生产菌,发酵培养基为鼓皮水解液、玉米浆、蛋白陈和矿物质等在发酵过程中,利用大肠杆菌产生的谷氨酸脱羧酶GAD用,将L一谷氨酸转化为GABA,然后分离纯化得到产品,而酶工程生产的γ-氨基丁酸主要作为饲料添加剂使用。

 

 本项目生产技术

本项目采用基因工程大肠杆菌高效表达L-谷氨酸脱羧酶GAD,以L-谷氨酸为底物,通过酶促反应工业化生产γ-氨基丁酸,γ-氨基丁酸底物转化浓度达到400g/L以上,放罐GABA浓度高达270g/L以上,24小时内转化率达到96%以上,转化反应规模已稳定达到5吨,工艺先进可行。

 

四、项目工艺流程简介

 

                                 发酵流程图            

                               划平板,37℃培养

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                         挑取单克隆菌体,振荡培养过夜

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                                  接种子摇瓶

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                                  配制发酵罐

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                                  灭菌121℃

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                              接种,调节通气量

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                                  诱导表达

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                           20h后放罐,离心收集菌

 

                                 转化流程图

 

                               底物投入转化罐中

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                                   用水稀释

                                      ↓

                                  酸碱调节pH

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                            将热菌体加入到转化罐中

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                                   开始转化

 

                                 纯化流程图

                            离心后的转化液加热30min

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                                  离心取上清

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                              活性炭脱色(20min)

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                                     抽滤

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                                 滤液旋蒸70℃

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                                   加入辅料

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                                   喷雾干燥

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                                     包装

 

五、设备

1、高通量菌种筛选优化反应器

2、发酵罐、结晶罐、储罐

3、管式离心机、活性炭

4、旋转蒸发仪

5、喷雾干燥仪